做過(guò)PCR實(shí)驗(yàn)的朋友都知道，熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)過(guò)程產(chǎn)生的熒光信號(hào)十分微弱，并有一定的背景信號(hào)，這就好比眾里尋他千百度，他還不知在何處......
這對(duì)PCR儀的光學(xué)檢測(cè)技術(shù)提出了很高的要求，光學(xué)檢測(cè)技術(shù)一直是qPCR儀的核心技術(shù)，它決定了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性、可靠性和重復(fù)性。
下面我們一起聊下熒光定量PCR儀的光學(xué)系統(tǒng)吧。
按照結(jié)構(gòu)的不同，熒光定量PCR儀的傳導(dǎo)光路主要分為斜射式、透射式和共聚焦式。傳導(dǎo)光路的主要作用是傳輸激發(fā)光和產(chǎn)生的熒光。
圖1
共聚焦式是其中使用較廣的一種檢測(cè)光路方式，如圖1所示，激發(fā)光路的激發(fā)光經(jīng)過(guò)二向色鏡反射后照射到待檢測(cè)樣品池上，產(chǎn)生的熒光會(huì)透射過(guò)二向色鏡再到達(dá)熒光探測(cè)器。
朗基科儀的熒光定量PCR頂部檢測(cè)方式就是使用了這種共聚焦傳導(dǎo)光路，激發(fā)光路和檢測(cè)光路采用同一光學(xué)光路，從而有效抑制了激發(fā)光和雜散光的干擾，提高了系統(tǒng)的信噪比。
一般情況下，根據(jù)光產(chǎn)生的原理和電傳播原理，一個(gè)完整的熒光信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)需要光源、透鏡、濾光片及探測(cè)器組成。
那么探測(cè)器的選擇也至關(guān)重要。對(duì)探測(cè)器的要求是高靈敏度、響應(yīng)速度快、噪聲低。
CCD
電荷耦合器件（ＣＣＤ）是2０世紀(jì)７０年代發(fā)展起來(lái)的一種具有將光轉(zhuǎn)換為電荷的傳感器，它使得圖像處理變得可能，它們由一系列被稱為像素的排列成正方形或矩形陣列的感光元件組成。當(dāng)ＣＣＤ曝光時(shí)，形成被觀察物體的圖像，該圖像可以從ＣＣＤ中提取并存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)上用于以后的分析。ＣＣＤ廣泛應(yīng)用在計(jì)算機(jī)圖像處理、醫(yī)學(xué)診斷、非接觸性檢測(cè)等領(lǐng)域，尤其適用于圖像識(shí)別技術(shù)。
由于CCD光敏管可做的很小(約10um)，所以它的圖像分辨率很高。CCD相機(jī)創(chuàng)建的圖像質(zhì)量高、噪點(diǎn)低。同時(shí)CCD相機(jī)已大批量生產(chǎn)很長(zhǎng)一段時(shí)間，產(chǎn)品更成熟，像素更高。
這種采用共聚焦式傳導(dǎo)光路以及選用CCD作為探測(cè)器的光學(xué)系統(tǒng)，在儀器界內(nèi)稱為頂部檢測(cè)CCD成像方式。
它是目前熒光定量PCR儀的蕞佳光學(xué)檢測(cè)技術(shù)方案。國(guó)內(nèi)頂尖qPCR儀和國(guó)外主流qPCR儀都采用這種技術(shù)，比如美國(guó)Thermofisher的Q5/7500，ROCHE的LC480/96，國(guó)內(nèi)有朗基的Q1000/Q2000系列產(chǎn)品。
這種頂部檢測(cè)技術(shù)采用相機(jī)原理，直接從PCR管的上方對(duì)所有樣品進(jìn)行同步實(shí)時(shí)檢測(cè)，采光面平行性好，采光面積大，因此小體積反應(yīng)液都能放心使用（如圖2）。
圖2 10ul，2倍稀釋4個(gè)重復(fù)
在Q2000上獲得的結(jié)果
眾所周知，采用頂部檢測(cè)技術(shù)的qPCR儀所需要的反應(yīng)體積只需10-20ul即可，（而其他檢測(cè)方案的qPCR儀至少需要20ul以上），從而很大程度地降低了實(shí)驗(yàn)成本。實(shí)驗(yàn)達(dá)人們蕞清楚qPCR試劑有多貴了，能省一半的試劑就是省下大把的銀子啊。
行業(yè)內(nèi)比較常用的檢測(cè)方式還有機(jī)械掃描技術(shù)和光纖技術(shù)。
1. 運(yùn)動(dòng)的機(jī)械部件不可避免會(huì)產(chǎn)生發(fā)熱、磨損及走偏等現(xiàn)象，導(dǎo)致故障率高。雖然儀器成本低，但后期維護(hù)成本非常高;
2. 逐孔掃描，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)效率低。
1. 光纖直徑比頭發(fā)絲還細(xì)，通光量非常低，導(dǎo)致熒光信號(hào)弱，難以收集;
2. 容易折斷，彎曲半徑大，導(dǎo)致儀器尺寸大;
3. 光纖表面容易被污染，不易清潔，極易堵塞，導(dǎo)致信號(hào)不穩(wěn)定。
不同的檢測(cè)方式會(huì)給后續(xù)檢測(cè)帶來(lái)不同程度的影響，在了解完以上光學(xué)系統(tǒng)的核心技術(shù)之后，小伙伴們應(yīng)該心中有譜了吧？小朗希望各位都能買到一臺(tái)稱心如意的qPCR儀。
